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本制品是基于RiboGreen染料法对RNA进行定量的试剂盒，RiboGreen染料是一种超灵敏的荧光核酸染料，用于溶液内RNA的定量检测。

在大量分子生物学实验过程中对微量RNA的检测和定量特别重要，这些过程包括：体外转录RNA产量的测定，以及在进行Northern Blot、S1核酸酶实验、RNase保护实验、cDNA文库制备、逆转录PCR和差异显示PCR前对RNA浓度的测定。核酸浓度测定最常见的方法是测量260nm波长处的吸光值(A260)，然而，基于吸光值检测法主要的缺点在于蛋白和游离核苷酸对光信号具有较大的干扰，以及检测灵敏度较低(A260=0.1相当于溶液中4?g/mL的RNA)；而应用灵敏的荧光核酸染料能避免很多由于这些因素引起的问题。

• 探针与RNA结合后的最大激发波长~500nm，最大发射波长~525nm。
  
• 通过荧光酶标仪、标准的荧光光度计或滤光荧光计来测量，能定量浓度低至1ng/mL的RNA。
  
• 灵敏度高，200μL的反应体系可检测低至200pg RNA，这一灵敏度比基于溴化乙锭的荧光分析法高200倍，比基于紫外吸收峰的分析法高1000倍。
  
• 使用两个染料浓度，为200×(High-range assay)和2000×(Low-range assay)，即使体系内存在核酸制备物中常见的几种杂质(包括：核苷酸、盐类、尿素、乙醇、氯仿、表面活性剂、蛋白和琼脂糖)，RiboGreen染料可测量的RNA浓度线性范围仍能达3个数量级，从1ng/mL到1μg/mL RNA。其中，高宽度实验(High-range assay)能定量1ng/mL-50ng/mL的RNA，低宽度实验(Low-range assay)能定量1ng/mL～50ng/mL的RNA。
  
• 由于RiboGreen染料也会结合DNA，需先用DNase预处理混合样品，再用RiboGreen染料进行RNA选择性的定量分析。
  
• 本品以溶于DMSO的母液形式提供。

组分	规格
RiboGreen染料	20T
说明书	1份

保存：-20℃，避光，有效期1年。


本制品可供2mL体积的20次RNA的高宽度定量，200次RNA的低宽度定量。


RNA样品，无核酸酶水，20×TE缓冲液(RNase-free)，RNA Standard，荧光比色皿以及荧光光度计/全黑96孔板以及荧光酶标仪，10×DNase digestion buffer，无核糖核酸酶的DNase I。


一、反应缓冲液准备

1. 于实验前，将20×TE缓冲液(RNase-free)用无核酸酶水稀释到1×TE缓冲液，用于稀释RiboGreen染料和RNA样品。注意：必须保证TE缓冲液没有受到核酸及核酸酶的污染。

二、确定染料浓度

2. 在RiboGreen染料的RNA定量检测中，为了获得完全的线性动力学范围，需要使用两个不同的染料浓度。在准备RiboGreen染料的工作液之前(见下试剂准备)，需要先决定是希望测定高宽度实验(High-range assay，20ng/mL-500ng/mL RNA)，还是低宽度实验(Low-range assay，1ng/mL-50ng/mL RNA)，或两个范围都要检测。

三、RiboGreen染料水溶性工作液的制备

3. 实验当天，在无菌的一次性聚丙烯塑料管内制备RiboGreen染料水溶性工作液。
   
4. 在5μL RiboGreen染料中加入1×TE缓冲液至2mL，得到高宽度实验的RiboGreen染料水溶性工作液；在0.5μL RiboGreen染料中加入1×TE缓冲液至2mL，得到低宽度实验的RiboGreen染料水溶性工作液。
   • 制备好的RiboGreen染料水溶性工作液需避光保存。最好在工作液配制后数小时内用完，不要长期保存待用。
     
   • 避免使用玻璃器皿，因RiboGreen染料可能粘附到玻璃表面。

四、制备RNA标准曲线

对于标准曲线，可以使用商业化的RNA Standard，比如：普遍使用的16S和23S核糖体RNA；或其它纯化的RNA制品。有的时候，推荐使用与待测定样本类似的RNA标准来建立标准曲线。一般来说，绝大多数单链的RNA分子能产生几乎等同的荧光信号。在核苷、盐、尿素、乙醇、氯仿、去污剂、蛋白质和琼脂糖这些常见的污染核酸试剂的化合物存在时，RiboGreen染料的检测结果仍可维持良好的线性关系，即使荧光强度可能会受到影响。为了确保达到有效的对照，用于制备标准曲线的RNA溶液应该与待测样本保持一致，这样能保证含接近相似水平的杂质化合物。

5. 在塑料瓶中用1×TE缓冲液配制浓度为2μg/mL RNA溶液。用比色杯在1cm长度通路下测量该RNA溶液在260nm (A260)下的基本吸光值，A260＝0.05相当于RNA浓度2μg/mL。
   
6. 制作High-range标准曲线时，通过稀释2μg/mL RNA溶液配制一系列的2×终浓度RNA标准溶液至一次性无核酸酶的塑料管中，最后转移到比色皿或培养板中。
   
7. 制作Low-Range标准曲线时，通过稀释2μg/mL RNA溶液配制一系列的2×终浓度RNA标准溶液至一次性无核酸酶的塑料管中，最后转移到比色皿或培养板中。
   
8. 等体积混合RiboGreen染料工作液和2×RNA标准溶液。于室温避光孵育2～5min。务必确保测量容器内加入了足够体积的测量液，对10×10mm比色皿来说，不能低于2mL；对96孔板的各孔来说，不要低于200μL。
   
9. 选择使用荧光光度计或荧光酶标仪来测定样本荧光值，选择标准的荧光素波长(激发~480nm，发射~520nm)。
   
10. 将每个样的荧光值减掉空白的荧光值。之后使用校正好的荧光值为纵坐标，RNA浓度为横坐标，来建立标准曲线。

五、样本分析

11. 用1×TE缓冲液稀释样品到合适体积(比如：1.0mL到10×10mm比色杯或100μL到96孔微孔板)。
    
    • 最好每个待测样本做不止一个稀释倍数。待测样本稀释倍数越高，越有助于降低特定污染物的干扰作用。然而，也要避免特别小的样本体积，因为难以准确测量。
      
    • 同一个实验中，杂质水平尽量保持一致，要降低杂质引起的样品之间信号差异。例如，如果一系列RNA样品含盐浓度相差很大，那么它们就无法用一个简单的标准曲线来进行比较。为了避免这样的问题，如果可能，调整所有样品中杂质浓度到相同水平。
12. 每个样品中加入等体积RiboGreen染料测量试剂，于室温避光孵育2～5min。
    
13. 选择与标准曲线测定时相同的仪器参数来测定样本荧光值。为了降低光漂白效应，所有样本的荧光测定时间保持不变。将每个样的荧光值减掉空白的荧光值。根据已经产生的RNA标准曲线来确定样本的RNA浓度。可能的话，通过做不同的样本稀释再重复测定，来验证定量结果。

六、样本中的DNA清除
RiboGreen染料也可以结合DNA。可以先用无RNA酶的DNA酶来去除样本中的DNA，从而避免由于DNA和RiboGreen染料结合产生的荧光干扰，确保样品中的荧光全部来自RiboGreen染料和RNA的结合。

14. 准备10×DNase digestion buffer：200mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM MgCl₂，20mM CaCl₂，Nuclease-free。
    
15. 向每个含DNA样品中加0.11倍体积的10×DNase digestion buffer。
    例如，如果样品为9mL，就加入1mL的10×DNase digestion buffer。
    
16. 按照1μg DNA添加~5U RNase-free DNase I。
    
17. 37℃孵育90min。
    
18. 用1×TE缓冲液至少10倍稀释样品以降低消化液中残留盐离子对RiboGreen染料测量产生干扰。
    
19. 按照上述步骤进行RiboGreen染料测定实验。

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